Tipificação Genômica de Mycoplasma gallisepticum por Amplificação Polimórfica Randomica de DNA (RAPD)
E. Mettifogo
M. R. Buim
A. J. P. Ferreira
M. Buzinhani
J. Timenetsky
Introdução
Mycoplasma gallisepticum (MG) provoca a doença crônica respiratória (DCR) nas galinhas e sinusite infecciosa dos perus, sendo considerado uns dos maiores responsáveis por prejuízos
econômicos à indústria avícola. O controle desta doença é realizado por meio de medidas de biossegurança, tratamentos dos lotes infectados e vacinação. A vacina MG-f atenuada ainda é muito utilizada, principalmente nas poedeiras.
Eventualmente, esta vacina pode reverter para a forma patogênica e causar infecções. Além disso, os testes sorológicos utilizados na rotina, não distinguem os anticorpos vacinais daqueles originados de infecção natural. Em conseqüência disso, a vacinação não é permitida em aves reprodutoras. A técnica de RAPD tem sido utilizada para estudos epidemiológicos entre organismos correlacionados ou para diferenciar cepas de uma mesma espécie, detectando polimorfismos (1,2). Esta técnica utiliza primers escolhidos aleatoriamente e não exige o conhecimento prévio da seqüência de nucleotídeos do DNA alvo. O perfil das bandas geradas é o resultado da hibridação do primer a seqüências específicas e da amplificação da região flanqueada por estas.
A análise visual dos esferogramas possibilita a diferenciação entre as cepas, não sendo possível uma análise de similaridade entre as cepas. Neste trabalho, alem da otimização dos parâmetros e do teste de diversos primers e ciclos para a RAPD, foram utilizados modelos matemáticos, com o objetivo de melhorar a análise de similaridade entre as cepas de referência, cepas de vacinas e isolados de campo de MG.
Material e Métodos
Cepas de MG utilizadas: 5969, s6, i, r, a, ts-11 e f (vacinais); isolados de campo identificados previamente como MG-f pela PCR com primers específicos (3): 1a, 1b, 1c, 1d, 36, 88 e 93.
A extração do DNA cromossomal foi realizada pelo método de fervura (1). Inicialmente, os parâmetros de amplificação foram otimizados: concentração de DNA alvo, tampão da reação, MgCl 2 , dNTPs, Taq DNA polimerase (Gibco) e primer.
Dois ciclos de amplificação com variações de temperatura de anelamento foram testados. O perfil dos fragmentos foi fotografado e analisado pelo Sistema de Foto Documentação Vilber-Lourmat, o qual calcula o peso molecular dos fragmentos. Após a padronização do RAPD, foram testados 27 primers. O dendograma foi extraído pela análise por UPGMA com coeficiente de Jaccard.
Resultados e Discussão
Dos 27 primers testados, o 1254 (2) apresentou os melhores resultados. Observa-se pelo dendograma a separação das cepas em grupos (clados). A cepa vacinal MG-f e os isolados identificados como cepa f foram agrupados em um mesmo clado. Os isolados obtidos de um mesmo embrião de incubatório, a partir de pulmão (1a), sacos aéreos (1b), traquéia (1c) e articulação (1d) foram classificados como idênticos, enquanto que os isolados de outros embriões do mesmo incubatório (2 e 4), foram similares entre si, mas com pequena
divergência, permanecendo no mesmo clado. Os isolados 36, 88 e 96, provenientes de uma granja de poedeiras com histórico de vacinação, apresentaram maior similaridade com a cepa F vacinal.
Figura 1. Dendograma mostrando a análise da similaridade por UPGMA entre as cepas e isolados de MG.
Conclusão
O método de RAPD e a análise por modelos matemáticos apresentaram capacidade discriminatória e podem ser aplicados em estudos epidemiológicos sobre as relações ou a diversidade genética de cepas de MG.
Bibliografia
1. Fan HH, Kleven SH, Jackwood MW. Avian Diseases 1995; 39: 729-735.
2. Geary SJ, Forsyth MH, Aboul Saoud S, Wang G, Berg, DE, Berg CM Molecular Cellular Probes 1994; 8: 311-316.
3. Nascimento ER, Yamamoto R, Khan MI. Avian Diseases 1993; 37: 203-211.
