Método de Elisa com Proteína N Recombinante do Vírus da Bronquite Infecciosa para Detecção de Anticorpos das Classes IgG, IgM E IgA
Conceição, DG
Santos, IL
Montassier, MFS
Gibertoni, AM
Furuyama, CRAG
Montassier1, HJ
INTRODUÇÃO
O diagnóstico rápido e a determinação do estado imunitário de um lote de aves de uma granja são de suma importância para o controle da bronquite infecciosa (BI) (1,5) . As técnicas imunoenzimáticas realizadas com padrões apropriados se revelaram eficientes na detecção e mensuração de anticorpos (Acs) específicos para o vírus da BI (VBI), facilitando o monitoramento do estado imunitário ou o sorodiagnóstico de um grande número de amostras de soro nas criações avícolas comerciais (1,5). A proteína de nucleocapsídeo (N) é um dos principais polipeptídeos estruturais do VBI e se constituí no antígeno (Ag) ideal para se fazer o desenvolvimento de testes sorológicos para a detecção de Ags grupo-específicos deste vírus (1,3,4). Atualmente, as partículas virais inativadas do VBI são usadas como Ags adsorvidos à fase sólida de placas de Kits comerciais de ELISA, que é empregado na detecção de Acs anti-VBI. A purificação viral necessita da propagação de grandes volumes de vírus em ovos embrionados SPF ou em culturas celulares(1,2,3,5). Ademais, o ELISA com proteína N recombinante já foi desenvolvido e mostrou a sua eficácia (1,3), porém, tal método de ELISA com esse tipo de Ag recombinante, nunca foi utilizado para a detecção/mensuração de isótipos de Acs anti-VBI específicos (IgG, IgM e IgA). Assim sendo e já tendo disponível uma preparação de Ag da proteína N recombinante do VBI expressa em leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae, foi conduzido o presente estudo, visando a mensuração de Acs de cada um desses 3 isótipos em galinhas vacinadas e não vacinadas e, depois, infectadas experimentalmente.
MATERIAL E MÉTODOS
Para este experimento foram utilizadas 20 aves SPF da linhagem leghorn white que foram colocadas em um isolador com pressão positiva. Dez aves foram vacinadas aos 28 dias de idade pela vacina Bioral H120 da Merial e outras dez permaneceram como controle negativo da imunização. Três semanas depois, essas aves foram infectadas experimentalmente com 105 DIE50 da estirpe virulenta M41. Amostras de soro sanguíneo e de secreção lacrimal foram colhidas no dia do desafio e 5 dia após. As mensurações de Acs dos isótipos IgG, IgA e IgM contra as estirpes H120 e heterólogas, A034 e Arkansas, foram realizadas através da técnica de ELISA-Indireto com a proteína recombinante expressa em leveduras (Y-N-ELISA) (3).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ao serem testados pelo método Y-N-ELISA, verifica-se que as galinhas vacinadas ou as infectadas com a estirpe M41 do VBI, reconheceram a proteína N recombinante expressa pelas leveduras, como antÍgeno desse mesmo vírus. Esta proteína recombinante revelou elevada antigenicidade, sendo assim capaz de reagir com intensidade relativamente elevada com os anticorpos induzidos pela vacinação ou infecção com o VBI e que pertenciam aos diferentes isótipos testados (IgG, IgA e IgM), tanto no compartimento sanguíneo (soro), quanto no compartimento das mucosas (secreção lacrimal) de aves vacinadas ou infectadas. Também ficou claro que mesmo as aves previamente vacinadas, após o desafio, apresentaram, após o desafio, um aumento de sua resposta imune humoral, revelado principalmente por um acréscimo mais acentuado, tanto no soro sanguíneo, como na secreção lacrimal, nos níveis de Acs da classe IgG e IgA contra a proteína N do VBI, enquanto que nas aves controles, não vacinadas, foram detectadas, nesse mesmo intervalo, elevações nos níveis de Acs anti-proteína N das classes IgM (soro sanguíneo e secreção lacrimal) e IgA (secreção lacrimal). Nas aves vacinadas foi encontrado, no período pré-desafio, apenas um aumento de Acs da classe IgG contra a proteína N, na secreção lacrimal.
CONCLUSÕES
A técnica de ELISA realizada com a nucleoproteína recombinante do VBI expressa em leveduras foi capaz de detectar Acs dos isótipos IgG, IgA e IgM, tanto no soro sanguíneo como na secreção lacrimal de aves vacinadas ou não e posteriormente infectadas experimentalmente com a estirpe M41 desse vírus.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Chen, H., B. Coote, S. Attree, and J. A. Hiscox. Avian Pathol. 32:519-526, 2003.
Marquardt, W. W., D. B. Snyder, and B. A. Schlotthober. Avian Dis. 25:713-722, 1981.
Ndifuna, A., A. K. Waters, M. Zhou and E. W. Collisson. J.Virol.Methods. 70:37-44, 1998.
Saif, L. J. Vet. Microbiol. 37:285-297, 1993.
Snyder, D. B., W. W. Marquardt, E. T. Mallinson, and E. Russek. Avian Dis. 25:213-222, 1983.
AGRADECIMENTOS
Fapesp/ CNPq / Embrapa / MERIAL
