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Sanidade
Identificação de Isolados do Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas com RT-PCR Universal e Análise por RFLP de Parte do Gene N
J.T. Abreu
J.S. Resende
S.L.T Santiago
N.R.S Martins
M.A. Jorge
INTRODUÇÃO
A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença viral altamente contagiosa de galinhas e amplamente disseminada, resultando em perdas econômicas importantes para a avicultura industrial, devidas ao aumento de mortalidade, condenações em abatedouros, queda na produção e na qualidade externa e interna dos ovos. A etiologia é um vírus membro da família Coronaviridae, genoma RNA fita simples, de polaridade positiva, não segmentado, de aproximadamente 27,6 kb de comprimento. O vírion é envelopado, pleomórfico, contendo 3 proteínas estruturais, sendo a nucleoproteína (N) localizada no interior do mesmo, estando intimamente associada ao genoma viral e apresentando interações com as demais proteínas (S: da espícula e M: transmembrana). Importantes funções biológicas são associadas à fosfoproteína N, sendo essas a de proteção parcial do genoma viral, regulação da replicação viral, interação com o rRNA e envolvimento no agrupamento e brotamento das partículas víricas das células infectadas. O diagnóstico da infecção pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG) pode ser realizado por diversos procedimentos laboratoriais tais como o isolamento em ovos embrionados de galinhas SPF ou cultivos de anéis traqueais e sua detecção por reações imunoenzimáticas específicas ou por sondas moleculares em hibridizações in situ. Entretanto, tais métodos são laboriosos, demorados e, em alguns casos têm levado a resultados conflitantes no que se refere às afinidades e diferenças entre as amostras (2). Este trabalho descreve o uso de uma RT-PCR universal específica para uma região conservada do gene da proteína N (1, 3) com modificações, objetivando melhorar o diagnóstico do VBIG baseado na detecção deste gene e confirmação por digestão com enzima de restrição (RFLP).
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido e realizado no Setor de Doenças das Aves do DMVP/ EV/ UFMG. Foram utilizadas nove estirpes de referência do VBIG (sete americanas: M41, A5968, Ark-99 – ATCC, JMK, SE-17, Iowa 609 e Iowa 97 – SPAFAS e duas européias: 6-82 gentilmente cedida pela Dra. Jane K. A. Cook, H-52) e 15 isolados de VBIG oriundos de casos clínicos da doença (respiratória e/ ou renal) na avicultura mineira – plantéis não vacinados (14 de frangos de corte e uma de poedeiras). Os isolamentos foram realizados no Setor de Doenças das Aves do DMVP/ EV/ UFMG no período de 1972 a 1989. O RNA de cada isolado e estirpe viral foi extraído usando Trizol LSÒ (BRL) como descrito previamente (1,3) e o cDNA foi produzido usando SuperScript II RT Rnase H - (BRL) com oligos dirigidos para a região genômica conservada que codifica para a proteína N (3). Controles negativos incluíram líquidos alantóideos (LA’s) de ovos embrionados de galinhas SPF não inoculados com o VBIG e o vírus da doença de Newcastle (VDN) (estirpe LaSota). A RT-PCR foi realizada conformeZwaagstra et al. (3) e Adzhar et al. (1). Os produtos amplificados foram visualizados após eletroforese em gel de agarose 2% corados com brometo de etídio usando luz UV. A análise por RFLP foi realizada usando enzima de restrição específica para a seqüência nucleotídica de interesse (NCBI, Bethesda, EUA; WebCutter, Search Launcher, EUA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados concordam com os descritos por Adzhar et al. (1), baseado na metodologia proposta por Zwaagstra et al. (3), a respeito do caráter universal dos oligos para diagnóstico do VBIG. Produtos de PCR de aproximadamente 438 pb de todos os isolados e estirpes do VBIG estudados foram amplificados usando os oligos dirigidos para a seqüência do gene N, mas nenhuma banda em gel de agarose correspondente a amplificação do segmento genômico de interesse foi observada para os controles VDN e LA’s. A análise por RFLP dos fragmentos obtidos pela PCR possibilitou agrupar os VBIG em três diferentes grupos. Sete estirpes de referência e nove isolados de campo apresentaram o mesmo perfil de restrição obtido para M41. Três isolados de campo formaram um grupo independente, diferindo de todas as estirpes de referência e demais isolados de campo, concordando com o perfil de restrição obtido pelo programa WebCutter ( Search Launcher) para VBIG de quadros clínicos da doença em lotes de frangos de corte na Austrália, indicando a possibilidade de serem variantes genéticas. Duas estirpes de referência e três isolados de campo não apresentaram sítio de restrição para a enzima utilizada no estudo e formaram um outro grupo.
CONCLUSÕES
A RT-PCR realizada conforme estudos prévios (1, 3) mostrou seu caráter universal na detecção dos VBIGs brasileiros avaliados, sendo portanto uma ferramenta valiosa no diagnóstico da BIG. Alguns isolados apresentaram perfis de restrição atípicos quando comparados às estirpes de referência e com os demais isolados de campo, constituindo-se, provavelmente, de variantes geradas por alguma recombinação e/ou mutação nesta região do gene N. A RT-PCR e RFLP desenvolvidas podem ser recomendadas para a detecção e caracterização genética molecular de isolados de VBIG.
AGRADECIMENTOS
Apoio financeiro: FAPEMIG, FINEP, CNPq e FEP – MVZ-Coordenação Preventiva. Aos Drs. Áurea V. F. Flatschart e Roberto B. Flatschart pela colaboração.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADZHAR A, SHAW K, BRITTON P. et al. Avian Diseases; 25: 817-836, 1996.
LAI MMC, CAVANAGH D. Advances Virus Research; 18: 1-100, 1997.
ZWAAGSTRA KA et al. Journal of Clinical Microbiology; 30: 79-84, 1992
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