Análise da Expressão por RT-PCR em Tempo Real do Gene da Miostatina em duas Linhagens de Aves (Corte e Postura)
Julho 2007
HJ Alves*
1, ML Marchesin
1, EC Jorge
1, MC Ledur
2, LL Coutinho
1
1 Laboratório de Biotecnologia Animal – ESALQ/USP Piracicaba – SP – Brasil
2 Embrapa Suínos e Aves – Concórdia – SC - Brasil
Introdução
A avicultura é uma das atividades que mais tem crescido nos últimos anos. A produção de aves no Brasil vem crescendo na ordem de 10% a cada ano, resultado da constante atualização tecnológica do setor. Com o aumento na produtividade, a carne de frango tornou-se a proteína animal mais barata e acessível ao consumidor (
www.abef.com.br). Dentro deste contexto, estudos que envolvam análise da expressão de genes que atuam na formação da musculatura esquelética são de extrema importância para o avanço nas pesquisas em avicultura. Desde a sua identificação em 1997 (4), o gene da miostatina tem sido descrito como um importante regulador da formação da musculatura esquelética (2). Considerando-se o papel importante deste gene durante o desenvolvimento embrionário e também no músculo esquelético adulto, o objetivo deste trabalho foi comparar a expressão do gene da miostatina na musculatura peitoral de duas linhagens de aves com diferentes potenciais de crescimento: uma linhagem de corte (TT), selecionada para maior deposição de massa muscular e uma de postura (CC), caracterizada pela baixa taxa de crescimento e pouca massa muscular.
Material e Métodos
Este experimento foi realizado no Laboratório de Biotecnologia Animal ESALQ/USP, Piracicaba-SP. Ovos provenientes das linhagens TT e CC da Embrapa Suínos e Aves foram incubados (38 ºC) para a obtenção de embriões de 9 (E9) e 17 dias (E17). Foram utilizados também pintinhos de 1 dia (D1) e aves de 21 dias (D21) de idade. Amostras do tecido peitoral das aves foram utilizadas para extração de RNA total e síntese de cDNA. As reações de RT-PCR em tempo real foram realizadas no equipamento LightCycler (Roche). Dessa forma, foram analisados cinco animais (musculatura peitoral), em duplicata, de cada linhagem em duas fases de desenvolvimento: fase embrionária (9 e 17 dias de incubação) e fase pós-eclosão (1 e 21 dias de idade). Foi empregado o método de quantificação relativa utilizando-se o gene da beta actina como controle. Foram obtidos os valores de DCt para cada uma das linhagens e idades avaliadas de acordo com a seguinte fórmula:
DCt = Ct gene interesse (Miostatina) – Ct gene controle (beta actina) , onde Ct (threshold Cycle) = Ciclo onde a detecção da fluorescência ultrapassa o nível basal. Assim, quanto menor o valor de DCt maior a expressão do gene de interesse em relação ao gene controle.
Resultados e Discussão
De acordo com os dados apresentados na Tabela 1, na linhagem TT, a expressão de miostatina foi maior no estádio E9 do desenvolvimento embrionário, decrescendo aos 17 dias de incubação (E17) e aumentando ligeiramente na fase pós-eclosão. A expressão foi maior na linhagem de corte desde a fase embrionária até 1 dia de idade. Aos 21 dias de idade a expressão de miostatina tornou-se maior na linhagem de postura. Uma vez que a miostatina é um potente inibidor de diferenciação muscular, esperava-se que sua expressão fosse maior na linhagem de postura em todos os estádios analisados, porém, isso ocorreu somente aos 21 dias de idade. Talvez isso possa ser explicado pelo fato de existirem genes regulando a expressão da miostatina na fase embrionária, como é o caso da folistatina (3), a titina e vários outros, que atuam inibindo a miostatina (2). Por outro lado, Álvares (1) obteve maiores concentrações de transcritos para miostatina na linhagem de postura em todos os estádios embrionários estudados. Vale ressaltar que no referido estudo foram avaliados estádios embrionários anteriores a nove dias de incubação e, portanto, anteriores aos estádios avaliados no presente estudo.
Tabela 1 - Médias e desvios-padrão da expressão do gene da miostatina nas fases embrionária e pós-eclosão, descritas em unidades DCt
E9: 9 dias de incubação; E17: 17 dias de incubação; D1: 1 dia de idade; D21: 21 dias de idade; TT: linhagem de corte; CC: linhagem de postura. Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si pelo teste t (p< 0,10). n: nº de observações
Conclusão
Os dados gerados na análise de expressão permitiram traçar um perfil da expressão da miostatina nas linhagens estudadas. Tais resultados podem fornecer subsídios para o entendimento das bases moleculares das diferenças fenotípicas encontradas entre as linhagens envolvidas neste estudo.
Bibliografia
1. Álvares LE (Tese de doutorado) UNESP Rio Claro 2001; 132p.
2. Dominique J-E, Gerard C. Experimental Cell Research 2006; 312: 2401-2414
3. Kocamis H, Kirkpatrick-Keller DC, Richter J, Killefer J. Growth, Development and Aging 1999; 63: 143-150
4. McPherron AC, Lawler AM, Lee S-J. Nature 1997; 387: 83-90
Apoio financeiro: EMBRAPA/PRODETAB, FAPESP
